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免疫組化各步驟中應(yīng)注意事項(xiàng)

免疫組化,是應(yīng)用免疫學(xué)基本原理即抗原與抗體特異性結(jié)合的原理,通過(guò)化學(xué)反應(yīng)使標(biāo)記抗體的顯色劑(熒光素、酶、金屬離子、同位素)顯色來(lái)確定組織細(xì)胞內(nèi)抗原(多肽和蛋白質(zhì)),對(duì)其進(jìn)行定位、定性及定量的研究。在免疫組化試驗(yàn)中應(yīng)該注意以下事項(xiàng)。

1 .固定 :好用4%的多聚甲醛固定液。對(duì)于冰凍切片,甲醛固定有時(shí)比冰凍丙酮好;但對(duì)于不同的組織和抗原 ,可選用不同的固定液。 有時(shí)候商品化的抗體會(huì)有比較適合而推薦的固定液,請(qǐng)于購(gòu)置前注意說(shuō)明書。

Bouin S固定液:飽和750ml,甲醛250ml,冰醋酸50ml,其對(duì)組織的穿透力較強(qiáng),固定較好,結(jié)構(gòu)完整,但因偏酸,對(duì)抗原 有一定損害,且組織收縮明顯,不適于組織標(biāo)本的長(zhǎng)期保存。 PLP液:即高碘酸鈉-賴氨酸-多聚甲醛,適于固定石蠟切片。適于富含糖類組織,對(duì)超微結(jié)構(gòu)及許多抗原的抗原性保存較好。

2 .組織脫水,透明 :時(shí)間不能太長(zhǎng),否則在切片時(shí)容易碎片,切不完整。

3 .切片時(shí)展片: 有些組織在切片后難以在水中展開(kāi),這時(shí)可適當(dāng)?shù)卦谒屑尤霂椎我掖肌?/p>

4 .烤片: 60℃ 30分鐘或37℃ 24小時(shí),溫度太高或時(shí)間太長(zhǎng),抗原 容易丟失。

5 .蠟塊及切片的保存: 好在4℃保存

6 .脫片問(wèn)題 : Poly-L-Lysine(多聚賴氨酸)為目前免疫組化 染色工作中常用的一種防脫片劑,6ml的多聚賴氨酸溶液可按1:10稀釋成60ml的工作液,適合于需要酶消化、微波、高溫高壓的防脫片處理。如不行,可用雙重處理(APES和Poly-L-Lysine)的切片。在以上兩種條件都行不通的情況下,可用如下方法:切片在脫蠟前,放在APES 1:50 丙酮溶液中浸泡3分鐘,晾干,即可進(jìn)行下一步。

7 .滅活內(nèi)源性酶: HRP系統(tǒng):3%雙氧水滅活;AP系統(tǒng):3%HAc滅活。

8 .暴露抗原 : 對(duì)于石蠟切片的免疫組化實(shí)驗(yàn)時(shí),必須采用高溫加熱抗原修復(fù),這將有助于暴露抗原決定簇,從而增加免疫組化染色的強(qiáng)度(不同抗體的佳修復(fù)液請(qǐng)參閱抗體說(shuō)明書)。對(duì)于不同的組織,不同的抗原,不同的抗體,所采用的方法應(yīng)不一樣,可進(jìn)行熱修復(fù)、胰酶消化、既不修復(fù)也不消化。膠原還可以用胃蛋白酶消化等。

9 .封閉: 在山羊血清封閉,非特異性染色仍然較強(qiáng)時(shí),可延長(zhǎng)封閉時(shí)間或用濃縮血清封閉

10 .抗體稀釋: 應(yīng)遵循“現(xiàn)用現(xiàn)配”的原則,對(duì)于PBS稀釋的抗體一定要當(dāng)天使用。

11 .背景高: 在抗體濃度、反應(yīng)時(shí)間、反應(yīng)溫度等合適的條件下,如果背景依舊高,可采用含1‰ Tween20的PBS洗,特別是在顯色之前要多洗。

12 .返藍(lán): 在蘇木素復(fù)染后,可用堿性緩沖液(如PBS)或Na2HPO4的飽和溶液返藍(lán)。

13 .顯色: 一定要在顯微鏡下觀察,注意控制背景。

14. 在整個(gè)操作過(guò)程中,切片千萬(wàn)不能干燥,否則會(huì)有非特異性染色。

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